конспект лекций, вопросы к экзамену

Полимеразная цепная реакция

ПЦР – принцип метода заключается в выявлении специфического для данного вируса гена по данным банка генов, а после его идентификация в исследуемом материале с помощью ПЦР.

В ходе ПЦР происходит амплификация ДНК-вируса – создание дополнительных копий гена. Этот участок называется амплификат, его границы определяются двумя праймерами комплементарными начальным участкам противонаправленных нитей двойной спирали ДНК.

Суть

  • молекула ДНК подвергается нагреванию до 94С, что приводит к денатурации – разрушению водородных связей между нитями спирали ДНК;
  • отжиг до 52С в присутствии праймера (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, олигонуклеотид), трифосфатов и фермента ДНК-полимеразы
  • повышение до 72С, что приводит к синтезу новой молекулы ДНК, соответствующей начальной.

Процедуру проводят повторно до образования необходимого количества амплификата, необходимого для индикации.

Постановка реакции:

  • получение ДНК-образца (исследуемый образец) – материал суспендируют в буфере, добавляют NaOH и выдерживают при 37С 7 минут. Смесь нейтрализуют и центрифугируют, надосадочную жидкость содержащую ДНК или РНК используют при постановке реакции.
  • проведение ПЦР – амплификация выделенного фрагмента ДНК. За 3 часа из одной молекулы образуется до 1 млн копий.
  • Индикация. Полученный амплификат подвергают электрофорезу в агарозном геле для разделения молекул ДНК, после чего на электрофореограмме резко выделяется амплифицированная молекула в виде полос (это фрагменты ДНК, синтезированные в процессе амплификации со специфическим для каждого возбудителя праймером).

Данный метод позволяет с высокой точностью диагностировать инф.  болезни. Разработаны наборы для диагностики диареи, ринотрахеита, африканской чумы, ящура и т.д.

20.01.2017; 20:00
просмотров: 261